35X测序深度cfDNA申请出战MRD！

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35X的cfDNA测序深度，真的可以进行MRD检测吗？

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⑴ 近日，中国首个《肺癌MRD的检测和临床应用共识》出炉，指出基于NGS技术的MRD检测，其基本技术标准是可稳定检测出丰度≥0.02%的ctDNA，该标准约是国家卫健委临床检验中心《ctDNA基因突变检测室间质评》要求可稳定检测出丰度≥0.1%的ctDNA（适用于晚期高肿瘤负荷患者）的10倍，可见MRD检测对NGS技术要求更高；

⑵ 既往研究亦显示，早期肿瘤的肿瘤分数（Tumor Fraction，TF）较低，中位数约为0.02%（ctDNA TF与肿瘤负荷相关），目前的0.1%检测灵敏度无法有效满足MRD的检测：I期将漏检44%的MRD患者，IV期将漏检10%的MRD患者，ctDNA VAF LoD达到10^-4~10^-5将可大幅提高MRD检测灵敏度，故MRD检测技术更偏向于早检方向；

⑶ ctDNA MRD的检测下限（LoD）卡在0.02%，亦卡住了绝大多数基因检测公司/实验室的“脖子”，因为国家卫健委临床检验中心收集到的绝大多数基因检测公司/实验室自我宣称的ctDNA检测下限为0.1%~0.5%（其中还存在大量实验室检测能力无法达到宣称检测下限的情况），这也就意味着目前市场上绝大多数基因检测公司/实验室并不能提供可靠的早期MRD检测服务；

⑷ 超深度测序结合UMI错误校正的ctDNA检测似乎是MRD检测的最佳工具，但依然存在血浆样本中ctDNA含量太低的困扰（不管你的NGS检测方法有多好），尤其是早期根治性手术切除后将导致ctDNA TF进一步降低，极低丰度的ctDNA对检测技术的要求极高；

⑸ 按目前临床ctDNA检测常规采用的方法：10ml外周血，30~33ng cfDNA起始投入量（约10,000拷贝），结合文库构建的转化率，匹配超深度测序（数万及数十万X）和特（背）殊（景）生（抛）信（光）算法，理论上可做到0.02%的检出率（1条reads即为真，即使手工审核数据亦难以确定，国家卫健委临检中心指出仅在下机数据中进行reads手工审核存在突变reads并不能真实的反映样本中突变的真实性，存在突变reads可能50%真阳性，可能50%假阳性），但真实世界中亦难以稳定检测出丰度≥0.02%的ctDNA，因此需在样本量投入（样本量投入限制了有效测序深度）和检测分析技术上需要有所突破（成本也需要考虑）；

⑹ 类似上述策略的MRD检测方法有Signatera^TM（Natera ，100,000X 测序深度，ctDNA VAF LoD为0.01%），PCM^TM（Archer Dx， 2020年6月被Invitae收购，ctDNA VAF LoD为0.003%）和CAPP-Seq（Roche，ctDNA VAF LoD为0.02%-0.001%），果然，MRD检测对ctDNA的灵敏度要求从来没有让我们失望过；

⑺ 早期肿瘤MRD检测，ctDNA甲基化是一个出路，比如GRAIL，Guardant Health（GH），Burning Rock等，其中Guardant Health近期商业化的早期结直肠癌MRD检测产品Guardant Reveal，使用了ctDNA突变（LoD为0.01%；所以肺癌MRD共识要求的0.02% LoD并不过分）整合ctDNA甲基化，进而使MRD检测灵敏度提高36%（在100%特异性的情况下，灵敏度可达91%），这也告诉我们单独依靠ctDNA突变的指标进行MRD评估，灵敏度可能比较有限；

⑻ 早期肿瘤MRD检测，还有其他的出路吗？有！35X测序深度的cfDNA申请出战！深度不够，广度来凑！低深度的cfDNA WGS检测是一个出路，可行吗？可行！C2i Genomics已经将这种方法商业化成MRDetect了，利用全基因组的突变分析和肿瘤的定量动态监测，可以在非常低的水平上准确且灵敏地检出癌症，只要1ml血浆和35x测序深度! 研究者认为测序广度将取代测序深度，以克服血浆样本中ctDNA片段数量少的局限性（通过分析数千个参考点来实现超灵敏度）；

⑼ C2i Genomics，2019年成立（总部设在纽约，研发中心设在以色列），2020年6月，C2i Genomics完成A轮融资1200万美元，加速开发MRD检测方法MRDetect，仅使用2ml血液（1ml血浆）的低深度WGS检测，便可以提供监控各种类型实体肿瘤复发和治疗反应的服务；

⑽ MRDetect使用原发肿瘤组织和对照血的WGS检测，鉴定出患者的特异性体细胞变异（SNV及CNA），然后，将特异性肿瘤体细胞变异用来计算患者血浆样本中的全基因组肿瘤信号（血浆cfDNA采用35X低深度测序，使用相同的肿瘤前期分析），机器学习方法将MRDetect-SNV/CNV的TF检测灵敏度提高到10^-5，可满足MRD的检测；

⑾ MRDetect在肺腺癌（术后，n=39），结直肠癌（术后，n=19），黑色素瘤（免疫治疗后，n=2）中均证实了监测追踪肿瘤的效果，术后血浆样本中ctDNA监测到的患者，即使当时没有其他临床或影像学的发现，其肿瘤复发的概率也很高；

⑿ 此外，C2i Genomics也证明片段化组学（Fragmentomics）具有MRD检测的潜力，研究显示ctDNA片段比其他cfDNA片段短，故进一步开发了在患者来源的异种移植（PDX）样本上训练的核密度估计器（KDE），以基于片段大小特征区分肿瘤来源的cfDNA（ctDNA）和正常来源的cfDNA，未来多组学生物标志物联合的液体活检方法或许是个新的出路；

⒀ MRDetect的MRD分析不需要个性化，在临床上可能更容易推广，但其检测成本也不低，毕竟动不动就100G的数据量（3G，35X）；

⒁ 2021年3月，C2i Genomics收购经CLIA认证的测序实验室QNA Dx，以加快其MRDetect监测平台的商业化；

⒂ MRDetect是一种tumor-informed assays（肿瘤信息/知情分析）方法，即它需要优先对活检或手术的肿瘤组织样本进行测序以鉴定患者的特异基因组变异，然后进行后续的MRD检测，所以它的市场竞品主要是Signatera^TM（Natera）及PCM^TM（Archer Dx， 2020年6月被Invitae收购），期待以后能见到他们头对头的对比研究（虽然不太可能）；

⒃ 最后，还是那句话，实体肿瘤MRD检测的三个关键要素，1）必须高灵敏度（多组学生物标志物联合是个出路）；2）必须快速且易于使用；3）必须具有成本效益（此处并非指便宜）。

参考资料： 

1.《肺癌MRD的检测和临床应用共识》

2.《ctDNA基因突变检测室间质评结果报告》

3.Zviran, A., Schulman, R.C., Shah, M. et al. Genome-wide cell-free DNA mutational integration enables ultra-sensitive cancer monitoring. Nat Med 26, 1114–1124 (2020).

4.D’Amico P, Corvaja C, Gerratana L, Reduzzi C, Curigliano G, Cristofanilli M. The use of liquid biopsy in early breast cancer: clinical evidence and future perspectives. J Cancer Metastasis Treat 2021;7:3.

5.https://www.natera.com/wp-content/uploads/2020/11/Oncology-Clinical-Seeing-beyond-the-limit-Detect-residual-disease-and-assess-treatment-response-SGN_AV_WP.pdf

6.https://www.iaslc.org/iaslc-news/ilcn/tracerx-data-show-tracking-mrd-ctdna-heralds-disease-relapse

7.https://finance.yahoo.com/news/c2i-genomics-raises-12-million-110000637.html

8.https://investors.guardanthealth.com/press-releases/press-releases/2021/Guardant-Health-Launches-Guardant-Reveal-Liquid-Biopsy-Test-for-Residual-Disease-and-Recurrence-Monitoring-in-Patients-with-Early-Stage-Colorectal-Cancer/default.aspx

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